Desmistificando o biofilme na otite canina

Introdução

A otite é uma condição comumente encontrada na clínica veterinária geral, e as alergias são a principal causa desencadeante (gatilho) em cães. A inflamação do canal auditivo pode levar à proliferação secundária de bactérias ou leveduras e, quando deixada sem tratamento, a otite pode evoluir para uma condição crônica. Nesses casos, fatores perpetuantes, como a presença de otite média, a calcificação do canal auditivo externo ou a alteração da flora microbiana da orelha, podem entrar em cena, resultando no consequente aparecimento de cepas bacterianas mais virulentas 1.

Em determinados casos, especialmente quando patógenos específicos, como Pseudomonas spp., estão envolvidos, pode-se observar a formação de biopelícula ou biofilme 1. O biofilme é uma biomassa viva e complexa, com uma estrutura específica que, uma vez estabelecida, torna a sua eliminação muito difícil. Os microrganismos dentro do biofilme empregam vários fatores para torná-los mais resistentes tanto frente ao sistema imunológico do hospedeiro como à antibioticoterapia 2. O objetivo deste artigo é esclarecer o conceito de biofilme, proporcionando aos leitores as informações necessárias para reconhecer a sua presença, o que facilitará a implementação de estratégias terapêuticas adequadas.

O que está por baixo: desvendando o mistério do biofilme

O biofilme é uma estrutura complexa formada pelo acúmulo de microrganismos, criando um agregado bacteriano de composição única. O biofilme é composto predominantemente por água (90%), enquanto os 10% restantes são constituídos pela biomassa microbiana 2. Além da água, os principais componentes da matriz do biofilme são polissacarídeos extracelulares, DNA e proteínas. Essa combinação de componentes confere propriedades peculiares ao biofilme, o que tem implicações significativas para a sobrevivência e persistência das bactérias integrantes 3.

O desenvolvimento da estrutura tridimensional do biofilme ocorre em várias etapas. O processo se inicia com a fixação ou adesão de bactérias de vida livre, conhecidas como bactérias planctônicas, a uma superfície. Essa ligação torna-se irreversível, e as bactérias passam para um estado séssil. Posteriormente, elas se agregam para formar uma microcolônia e iniciam a produção da matriz extracelular mediante a ativação de genes específicos. Uma vez estabelecido o biofilme, fragmentos contendo bactérias planctônicas se desprendem e se dispersam no meio circundante, facilitando a disseminação do biofilme 2. Uma vantagem notável da formação de biofilme é a sua capacidade de estabelecer um gradiente das camadas mais externas para as mais internas, em termos de nutrientes, níveis de oxigênio, taxas de crescimento, e genética 4 (Figura 1).

Um dos principais fatores do biofilme bacteriano é a sua capacidade de criar uma barreira protetora resistente aos antibióticos. As bactérias incorporadas em um biofilme se encontram mais protegidas dos efeitos de tratamentos antimicrobianos, tornando as infecções associadas ao biofilme mais difíceis de erradicar 5. Além disso, o biofilme apresenta maior resistência aos estresses ambientais, inclusive dos ataques pelo sistema imunológico do hospedeiro – por exemplo, o biofilme pode ser resistente à fagocitose pelos leucócitos 6. Outro aspecto crítico do biofilme é a sua capacidade de transferência horizontal de genes. Em função da proximidade das células bacterianas dentro do biofilme, as trocas genéticas podem ocorrer de forma mais eficiente, facilitando a disseminação de características benéficas ou de resistência a antibióticos entre a população bacteriana 7. 

O mecanismo de autoindução ou quórum sensing (a capacidade de detectar e responder à densidade da população celular por meio de regulação genética) desempenha um papel fundamental no complexo processo de formação de biofilme. Basicamente, esse mecanismo permite que as bactérias coordenem o seu comportamento com base na sua densidade celular, possibilitando que esses microrganismos presentes em um biofilme sincronizem a produção de componentes-chave da matriz extracelular, como os polissacarídeos extracelulares 2.

Explorando a formação de biofilme: quais microrganismos estão envolvidos?

Tanto as bactérias Gram-positivas como as Gram-negativas têm a capacidade de formar biofilme. Entre as bactérias descritas com maior frequência nas infecções de otite canina, destacam-se as espécies de Pseudomonas, com alta incidência na formação de biofilme 8. O biofilme pode ser composto por uma única espécie microbiana ou por várias, um fenômeno conhecido como formação de biofilme polimicrobiano. Essa diversidade na composição do biofilme destaca a complexidade dessas estruturas e o seu papel em diversas infecções 9.

Outras espécies conhecidas em medicina humana pela produção de biofilme são Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus, e Enterococcus faecalis 2. Na medicina veterinária, observaram-se bactérias formadoras de biofilme, incluindo Staphylococcus spp. e E. coli, em outras locais diferentes da otite 10. Além disso, o conceito de biofilme não se limita apenas às bactérias: alguns fungos como Malassezia spp. também têm a capacidade de formar biofilme 11. Isso enfatiza o significado mais amplo da formação de biofilme abrangendo todas as espécies microbianas e salienta a importância de compreender e controlar o biofilme em vários contextos da clínica veterinária. Também ressalta a importância de não focar exclusivamente em Pseudomonas spp., mas sim investigar a possível presença de outros microrganismos. A identificação de patógenos é essencial para otimizar o tratamento eficaz dessas infecções. Como o biofilme pode ser uma comunidade complexa composta por várias espécies, é crucial adotar uma abordagem exaustiva, abrangente e multifacetada para abordar os diversos desafios possivelmente enfrentados na identificação dos patógenos responsáveis.

Para descrever a capacidade de formação de biofilme, é comum a utilização de uma escala de débil a forte, dependendo das cepas bacterianas ou fúngicas envolvidas 12; em um estudo, por exemplo, destacou-se que a Pseudomonas aeruginosa é uma forte produtora de biofilme, em comparação com outras espécies 13. Essa classificação dos níveis de produção de biofilme pode servir como uma ferramenta para avaliar o potencial de virulência e a resistência ao tratamento de diversas cepas bacterianas, auxiliando na tomada de decisões clínicas e nas abordagens terapêuticas; no entanto, ainda há necessidade de estudos para saber se essa classificação realmente tem um impacto clínico e terapêutico 12.

Revelando o biofilme: métodos de detecção e visualização

Detectar a presença de biofilme pode ser um grande desafio, uma vez que essa estrutura não costuma ser visível a olho nu e necessita de métodos de detecção específicos 14. Ao exame clínico, o aspecto macroscópico do biofilme pode variar, dependendo de sua maturidade, do tipo de microrganismos envolvidos e da região do corpo afetada (Figuras 2 e 3). Podem ser observadas diferentes características 14:

• Cor: pode variar de branco/translúcido a cinza/verde
• Textura: pode parecer viscosa, pegajosa ou mucoide
• Formato: pode exibir um aspecto plano ou tridimensional

Uma observação clínica no caso de infecção por Pseudomonas spp. é o aparecimento de biofilme clássico acinzentado/esverdeado, pegajoso, ou viscoso. Esse aspecto pode ser atribuído à presença de alginato, bem como à produção de piocianina 15.

A aparência citológica do biofilme depende dos microrganismos envolvidos e da técnica de preparo da amostra. Para visualizá-lo, podem ser usadas colorações especiais, como o Ácido Periódico de Schiff (também conhecido como PAS), que evidencia a matriz de polissacarídeos; entretanto, essas colorações não costumam estar disponíveis na rotina das clínicas veterinárias, o que dificulta a sua identificação 16. Contudo, vale notar que o biofilme pode aparecer como um aglomerado (cluster) de células (bactérias, esporos, hifas fúngicas), que são circundadas por uma matriz extracelular (que nem sempre é visível) e podem vir acompanhadas ou não de neutrófilos polimorfonucleares ou células mononucleares 17 (Figura 4).

A cultura bacteriana ou fúngica de microrganismos capazes de formar biofilme é um dos critérios diagnósticos para a identificação desse biofilme. Todavia, esse critério não deve ser considerado como “padrão-ouro”, uma vez que se podem obter resultados falso-negativos na cultura; além disso, constataram-se discrepâncias entre o exame de cultura bacteriana e o perfil do amplicon 16S 18. Os métodos tradicionais de cultura apoiam principalmente o crescimento de bactérias planctônicas, não conseguindo mimetizar com precisão as condições do biofilme. Portanto, o resultado do antibiograma pode não refletir o verdadeiro perfil de suscetibilidade antimicrobiana. Além disso, é difícil reproduzir as condições do biofilme a partir de culturas planctônicas em função das possíveis diferenças no estado de maturação das bactérias do biofilme da amostra e das bactérias da cultura. As bactérias do biofilme exibem uma resistência antimicrobiana consideravelmente maior, em comparação às suas contrapartes planctônicas, o que faz os resultados da suscetibilidade aos antibióticos (antibiograma) menos preditivos quanto à eficácia do tratamento 15. 

Essa limitação ressalta a necessidade de utilizar métodos alternativos, como o ensaio CVS (do inglês Crystal Violet Staining, Corante Cristal Violeta), com o uso de meio de cultura em caldo (por exemplo, caldo Luria-Bertani, caldo Mueller-Hinton, ou caldo Soja Tríptica (Tryptic Soy]), para avaliar a produção de biofilme com base em leituras de densidade óptica. Esses métodos oferecem uma compreensão mais completa e abrangente da presença de biofilme bacteriano e do seu possível impacto nos resultados do tratamento com antibióticos 8, mas não costumam ser utilizados para cultura bacteriana de rotina. Outros métodos que, apesar de úteis, também não são usados de forma rotineira, incluem 19:

• Microscopia eletrônica de varredura
• Microscopia eletrônica de transmissão
• Microscopia confocal de varredura a laser
• Hibridização fluorescente in situ 
• Biologia molecular, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), que detecta genes específicos associados à formação de biofilme

Considerando os desafios na visualização direta de biofilme, muitas vezes é necessário combinar vários métodos para obter uma identificação precisa e completa.

Controlando o biofilme: estratégias de manejo eficazes

Como mencionado anteriormente, o biofilme confere às bactérias uma resistência significativamente maior aos antibióticos, em muitos casos entre 100 e 1.000 vezes superior à das bactérias planctônicas 5. Por esse motivo, é essencial utilizar uma estratégia para romper o biofilme, permitindo assim que os tratamentos antibióticos e antifúngicos consigam combater de forma eficaz as infecções bacterianas e fúngicas. O desenvolvimento de novas soluções para controlar o biofilme não só pressupõe uma maior eficácia dos antibióticos, mas também a possibilidade de abordar os desafios enfrentados com as bactérias resistentes a esses agentes terapêuticos. Portanto, vale a pena fazer uma breve revisão de alguns tratamentos que costumam ser usados como coadjuvantes e demonstraram eficácia contra biofilmes.

NAC (N-acetilcisteína) é um agente mucolítico que também possui propriedades antimicrobianas. Embora o mecanismo de ação exato sobre o biofilme seja conhecido apenas parcialmente, demonstrou-se que esse agente atua como uma molécula capaz de dissolver essa biopelícula. Especificamente, a N-acetilcisteína inibe a adesão bacteriana, diminui a produção da matriz de polissacarídeo extracelular, e promove a ruptura de biofilme maduro ao dissociar as ligações dissulfeto dentro dessa matriz extracelular. Isso torna o biofilme mais permeável e suscetível aos tratamentos antimicrobianos 20. Além disso, a capacidade da N-acetilcisteína de destruir o biofilme foi demonstrada in vitro com cepas bacterianas do canal auditivo externo, a saber: Staphylococcus pseudintermedius e Pseudomonas aeruginosa. A eficácia desse agente mucolítico varia dependendo da concentração utilizada, recomendando-se em torno de 1-2% 13. Vale ressaltar que a N-acetilcisteína se mostrou segura durante a injeção intratimpânica em condições experimentais, o que a torna uma opção potencialmente viável e não ototóxica para o tratamento de otite com secreção crônica 21.

Tris-EDTA (ácido etilenodiaminotetracético-trometamina) exerce seus efeitos antimicrobianos através de um mecanismo de ação bem definido. O componente EDTA atua como um agente quelante, sequestrando cátions divalentes. Isso, por sua vez, rompe a membrana celular externa das bactérias Gram-negativas. Essa ruptura provoca a liberação de lipopolissacarídeos e torna as células bacterianas mais permeáveis a outros agentes antimicrobianos. Ao mesmo tempo, o componente Tris (i. e., trometamina) atua como um tampão, aumentando a capacidade de quelação do EDTA 22. Embora o Tris-EDTA tenha demonstrado uma atividade antibiofilme contra P. aeruginosa, seus efeitos sobre Staphylococcus spp. são variáveis e, na maioria das vezes, inibem o crescimento desses microrganismos, em vez de erradicá-los 13. Cabe assinalar que a combinação de Tris-EDTA com determinados agentes antimicrobianos pode levar a uma redução na eficácia antibacteriana, havendo a necessidade de mais pesquisas para compreender essas interações na sua totalidade. No entanto, o Tris-EDTA destaca como adjuvante em combinação com alguns agentes antimicrobianos, demonstrando um efeito sinérgico. Estudos in vitro demonstraram que o Tris-EDTA pode reduzir a concentração bactericida mínima (CBM) e a concentração inibitória mínima (CIM), aumentando assim a eficácia de antibióticos como marbofloxacino e gentamicina, especialmente em casos de P. aeruginosa multirresistente 22.

Além do Tris-EDTA, diversos outros compostos demonstraram atividade contra biofilme, diversificando o arsenal de ferramentas disponíveis no combate às infecções bacterianas. Por exemplo, nanopartículas de prata, iodopovidona e mel representam alternativas para o controle do biofilme 23,24. Ademais, as pesquisas em andamento no campo de biofilme estão trazendo grandes descobertas. Algumas inovações como o plasma frio atmosférico por micro-ondas, os inibidores do quórum sensing, e os bacteriófagos estão surgindo como possíveis agentes com efeito antibiofilme 23,25. Essas abordagens são promissoras no sentido de ajudar a enfrentar os desafios relacionados com o biofilme, oferecendo esperança para a implementação de estratégias terapêuticas mais eficazes no futuro.

Considerações finais

A formação de biofilme representa um importante fator de virulência em diversas infecções bacterianas, incluindo aquelas causadas por Pseudomonas spp. e Staphylococcus spp., especialmente no contexto de otites crônicas. Não obstante, é crucial não negligenciar o papel desempenhado pelas leveduras como a Malassezia spp. na produção de biofilme. Nos casos em que há uma falha do tratamento e se observam aspectos macro e microscópicos específicos, é fundamental considerar o possível envolvimento do biofilme. Suspeitar da presença de biofilme e detectá-lo podem levar a estratégias terapêuticas mais adequadas e aumentar a esperança de erradicar essas infecções tão persistentes.